Nằm trong phân họ Rái cá (Lutrinae) thuộc Họ Chồn, rái cá lớn là thành viên duy nhất của chi Pteronura. Hiện có hai phân loài được ghi nhận theo cuốn Những loài động vật có vú trên thế giới (Mammal Species of the World) là P. b. brasiliensis và P. b. paraguensis.[1] Những miêu tả không chính xác về loài này đã dẫn tới nhiều danh pháp đồng nghĩa (phân loài thứ hai thường được viết trong các tài liệu là P. b. paranensis).[1] P. b. brasiliensis phân bố suốt phần phía Bắc của khu vực phân bố của loài, bao gồm các hệ thống sông Orinoco, Amazon và ở Guyana; còn ở miền Nam, P. b. paraguensis được cho là sống ở Paraguay, Uruguay, miền Nam Brasil, và Bắc Argentina dù có thể chúng đã tuyệt chủng ở ba khu vực sau. Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) coi sự hiện diện của loài này ở Argentina và Uruguay là không chắc chắn.[2] Nghiên cứu đã cho thấy những quần thể còn sót lại phân bố rất mỏng ở Argentina.[9] P. b. paraguensis được cho là nhỏ hơn và tính bầy đàn cao hơn, với hình thái hàm răng và sọ khác biệt. Tuy nhiên, năm 1997 Carter và Rosas lại phản đối việc chia loài thành hai phân loài, chỉ ra rằng sự phân loại này chỉ từng được kiểm chứng một lần duy nhất vào năm 1968, và vật mẫu của P. b. paraguensis lại rất tương đồng với của P. b. brasiliensis.[10] Nhà sinh vật học Nicole Duplaix gọi đây là sự phân chia "đáng nghi ngờ."[11]

Satherium, một chi đã tuyệt chủng được coi là tổ tiên của loài rái cá lớn hiện nay, đã di cư tới Tân Thế giới vào thế Pliocen hoặc đầu thế Pleistocen.[8] Rái cá lớn sinh sống trên cùng lục địa Nam Mỹ với ba trong bốn thành viên của chi rái cá Lontra: rái cá biển Nam Mỹ, rái cá sông Nam Mỹ, và rái cá biển (mèo biển).[12] Chúng dường như đã tiến hóa độc lập với Lontra ở Nam Mỹ, dù có sự chồng lấn về khu vực phân bố. Loài rái cá lông mượt (Lutrogale perspicillata) của châu Á có thể là họ hàng gần gũi nhất còn tồn tại của loài này, khi chúng có tập tính, tiếng kêu và hình thái đồng tương đồng đã được ghi lại.[8] Cả hai loài này đều cho thấy có sự ghép đôi chặt chẽ và cả việc tham gia của rái cá bố trong việc nuôi dưỡng con non.[13]

Phân tích phát sinh chủng loại của Koepfli và Wayne năm 1998 đã phát hiện ra rằng rái cá lớn có trình tự di truyền khác biệt cao nhất trong phân họ rái cá, tạo thành một nhánh riêng biệt đã tách ra vào 10-14 triệu năm trước. Họ lưu ý rằng loài này có thể phát sinh từ nhánh cơ sở hoặc hoàn toàn tách biệt khỏi các loài rái cá khác, thậm chí có thể rẽ nhánh trước cả những loài chồn khác như chồn ecmin, chồn hôi và chồn vizon.[8] Một nghiên cứu xác định trình tự gen sau đó trên các loài Họ Chồn, kể từ năm 2005, đã đưa thời điểm rẽ nhánh của loài rái cá lớn muộn hơn, chỉ khoảng từ 5-11 triệu năm về trước; cây phát sinh chủng loại tương ứng đặt chi Lontra phân nhánh trước trong các chi rái cá, và Pteronura ở vị trí thứ hai, dù khoảng thời gian có sự chồng chéo.[14]